Jak používat GSH úrovně při detekci ROS

Glutathion , nebo GSH , jeneesenciální tripeptid z cystein , glutamát a glycin . Je to silný antioxidant, který chrání buňky a orgány vašeho těla před škodlivými účinky ROS , nebo reaktivních kyslíkových radikálů , které jsou tvořeny z molekulárního kyslíku v důsledku různých metabolických procesů v těle . Antioxidanty , jako je glutathion , neutralizují ROS a zabránit jim v interakci s a poškození DNA a bílkovin ve vašich buňkách . Poměr oxidované a redukované formy GSH v těle svědčí o ROS související oxidativního stresu ve vašem body.Things budete potřebovat
stříkačka
Butterfly jehly
odstředivka
heparin sodný
Mrazák
kyselina sulfosalicylovou
GSH Reaction agenta
mikrodestičku
Světelný zdroj klipart standardního roztoku GSH
Zobrazit další instrukce dovolená 1

Draw přibližně 2 ml krve ze žíly na anticubetal žíly s 23 - gauge butterfly jehlou až 5 ml injekční stříkačky . Přidat vzorku do zkumavek obsahujících heparin sodný a jemně invertovat trubice pro míchání .
2.

sbírat červené krvinky odstředěním vzorku při 2500 otáčkách za minutu po dobu pěti minut . Zmrazit a rozmrazit Vzorek se třikrát rozbít buňky . Odstředivka buněčného lyzátu řešení po dobu 10 minut při 12000 otáčkách za minutu a 4 stupně , a sbírat supernatant .
3

Vyjměte protein ze vzorku přidáním 5 procent kyseliny sulfosalicylové a centrifugaci vzorku 12000 rpm po dobu pěti minut při teplotě 4 ° . Skladujte deproteinated supernatant na -112 stupňů .
4

Mix detekční činidlo thiolové , GSH reduktázy , nikotinamid -adenin- fosfát dinukleotidovou a zkušebním pufru v poměru podle výrobce kitu , aby GSH reakční směsi . Množství každé chemické látky závisí na počtu testů , které chcete provést . GSH se reakční směs zředí v 5 procent kyseliny sulfosalicylové , aby se koncentrace 16 , 32 , 63 , 125 , 250 a 500 mikrolitrů .
5

Přidat 1-10 mikrolitrů vzorku deproteinated krve do jamek z mikrotitrační destičky . Přidat sériově zředěný standardní roztok GSH , který je k dispozici v testovací sadě , do každé jamky , aby celkový objem každé jamky 10 ul .
6

Přidat 90 ul GSH reakční směsi , které jste provedli v kroku 4, do každé jamky v mikrotitrační destičky . Smíchejte činidlo třepáním destičku po dobu 30 sekund.
7

okamžitě Změří se absorbance umístěním desky pod světlem s vlnovou délkou 405 a 415 nanometrů . Inkubujte destičku po dobu 30 minut. Vezměte absorbance po každých pět minut během inkubace .
8

Rozpusťte 6 mM zpracovaného vzorku s 5 procent kyseliny sulfosalicylovou a trifluromethane sulfonátového řešení . Tím se odstraní veškeré snížení GSH z roztoku . Přidat mezi 1 až 10 micoliters tohoto řešení do jamek mikrotitrační destičky a opakujte kroky 5 , 6 a 7 . To vám pomůže odhadnout množství oxidovaného GSH ve vzorku .
9

Plot absorbanci vzorku a koncentrace na grafu získat křivku GSH jak pro snížení a oxidovaného glutathionu . Vypočítá se poměr mezi oběma formami GSH . Zvýšené hladiny oxidativní hladiny GSH ukazují, oxidační stres a ROS .